[Todos] Defensa de Tesis- Lic. Graciela Priano- Miércoles 26 de ABRIL, 16h

[sara elizabeth bari]

Defensa de Tesis 

 

Lic. Graciela Priano

 

Director: Dr. Fernando Battaglini

 

 

 

Miércoles  26 de ABRIL, 16 h

Aula de Seminarios del Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, FCEyN, UBA

Ciudad Universitaria, Pabellón II, Piso 3

 

 

 Detección de Endotoxinas:

Bases para un Ensayo de Reconocimiento Molecular

 

Las endotoxinas, también conocidas como pirógenos, son constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas.  Ellas son responsables de inducir fiebre y la disfunción progresiva de distintos órganos cuando ingresan al torrente sanguíneo.  Los métodos aceptados para su detección son métodos biológicos: el ensayo LAL, basado en la gelificación del lisado de amebocitos provenientes del cangrejo herradura y el ensayo en conejos.

 

En el presente trabajo, se estudió la interacción de las endotoxinas con una proteína de reconocimiento inmovilizada sobre dos superficies distintas con el propósito de desarrollar un ensayo competitivo amperométrico. El primer escalón en este trabajo fue realizar una detallada investigación acerca de este tipo de moléculas.  Ellas son lipopolisacáridos que presentan ciertas características peculiares: la formación de  agregados aún a muy bajas concentraciones, la alta variabilidad en su peso molecular y la dificultad para determinar su presencia por métodos analíticos convencionales.  Fueron  establecidos un método para su purificación y pautas para la manipulación y operatoria con este reactivo.  

 

Fueron estudiadas dos configuraciones de electrodos modificados utilizando como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente una porción altamente conservada de este conjunto de moléculas.  La construcción de los electrodos fue seguida por técnicas electroquímicas y elipsometría, mientras que su funcionamiento fue evaluado en un ensayo competitivo, utilizando como elemento generador de la señal, un lipopolisacárido modificado con HRP.  Los electrodos construidos por interacción electrostática entre ENP y un polímero electroactivo permitieron detectar la presencia de endotoxinas en concentraciones tan bajas como 0.2 EU mL-1.  Los electrodos construidos por unión covalente de  ENP a una matriz de carboximetil dextran mostraron un mayor rango dinámico pero también un mayor límite de detección.  

 

Se presentó un modelo cinético para evaluar la respuesta electroquímica teniendo en cuenta los distintos métodos de inmovilización.

 

 

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