[Todos] PROXIMO SEMINARIO

[Fernando V. Molina]

Lunes 26 de mayo de 2008 - 13 hs

Aula de Seminarios del INQUIMAE, 3er piso Pab. II


Dr. Mariano Bossi


Microscopias avanzadas de fluorescencia de campo 
lejano con resolucion biomolecular


Resumen:
La microscopía de fluorescencia de campo lejano 
es una de las herramientas más utilizadas en las 
“ciencias vivas”, entre otras, debido a su alta 
especificidad, sensibilidad y carácter no 
invasivo. La resolución obtenible es ˜ 200 nm en 
el plano focal, limitada por la difracción. 
Muchos fenómenos de gran importancia ocurren a 
escala (bio)molecular (˜ 10-50 nm), y por ende 
son indetectables en microscopios convencionales. 
Recientemente, nuevas técnicas de microscopía 
permitieron sobrepasar la “barrera de la difracción” utilizando dos estados
moleculares de una sonda fluorescente no sólo 
para generar la señal, sino para mejorar la 
resolución[1]. Una de las formas posibles de 
utilizar estos estados se basa en la saturación 
de dicha transición, dando origen a la familia de 
microscopías RESOLFT (reversible saturable 
optical fluorescence transitions)[2]. Una nueva 
familia de técnicas también utiliza los estados 
moleculares de la sonda pero de manera 
distinta[3, 4]. El concepto se basa en 
foto-activar y localizar un número elevado de 
moléculas simples (MS) para reconstruir la imagen del objeto
en observación haciendo un mapeo de la posición 
de las sondas localizadas. La posición de estas 
moléculas puede ser determinada con una precisión 
por debajo del límite de difracción.
En el presente seminario se presentarán los 
avances realizados en ambos tipos de microscopías 
de alta resolución, utilizando compuestos 
fotocrómicos biestables o de largo tiempo de vida 
del estado no emisor. En primer lugar se 
discutirá la aplicación de este tipo de 
compuestos en microscopías RESOLFT, permitiendo 
utilizar bajas intensidades de luz[5]. 
Posteriormente se presentará la utilización de 
una nueva familia de sondas fotocrómicas y 
fluorescentes (Esquema 1)[6, 7] en microscopías 
de localización de MS, que permtió incrementar el 
número de fotones detectados (mejor resolución), 
realizar un proceso más efectivo de colección de 
imágenes (reducción del tiempo de adquisición) y 
reducir la señal de background (eliminando la 
necesidad de utilizar estabilizaciones 
mecánicas). Además, mediante la activación de 
amidas de rodaminas por absorción de dos fotones, 
se logró alcanzar resolución axial (seccionado y 
reconstrucción 3D de imágenes). Esto representa 
un avance considerable en comparación con la 
activación por un fotón que posee una 
prácticamente nula resolución axial (Figura 1). 
Se presentarán además aplicaciones de este tipo 
de microscopía utilizando varias sondas (imágenes 
multicolores), que confieren una mayor 
especificidad y permiten la realización de 
experimentos de colocalización de estructuras o biomoléculas.
Emacs!

Emacs!

[1] S. W. Hell, Science 2007, 316, 1153-1158.
[2] S. W. Hell, K. I. Willig, M. Dyba, S. Jakobs, 
L. Kastrup, V. Westphal, in Handbook of Biological Confocal Microscopy (Ed.: J.
Pawley), Springer, New York, 2006, pp. 571-579.
[3] E. Betzig, G. H. Patterson, R. Sougrat, O. W. 
Lindwasser, S. Olenych, J. S. Bonifacino, M. W. Davidson, J. Lippincott-
Schwartz, H. F. Hess, Science 2006, 313, 1642-1645.
[4] M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Nature Methods 2006, 3, 793-796.
[5] M. Bossi, J. Fölling, M. Dyba, V. Westphal, 
S. W. Hell, New J. Phys. 2006, 8, 275.
[6] J. Fölling, V. Belov, R. Kunetsky, R. Medda, 
A. Schönle, A. Egner, C. Eggeling, M. Bossi, S. W. Hell, Angew. Chem. Int. Ed.
2007, 46, 6266-6270.
[7] J. Fölling, V. Belov, D. Riedel, A. Schönle, 
A. Egner, C. Eggeling, M. Bossi, S. W. Hell ChemPhysChem 2008, 9, 321 - 326.
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